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Nature Communications volumen 14, número de artículo: 3961 (2023) Citar este artículo

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Los ficobilisomas (PBS) son los principales complejos captadores de luz de la fotosíntesis en las cianobacterias y las algas rojas. CpcL-PBS es un tipo de PBS pequeño en cianobacterias que transfiere energía directamente al fotosistema I sin la estructura central. Aquí informamos la estructura crio-EM del CpcL-PBS de la cianobacteria Synechocystis sp. PCC 6803 con resolución de 2,6 Å. La estructura muestra el dominio CpcD de la ferredoxina: la NADP+ oxidorreductasa se encuentra en el extremo distal de CpcL-PBS, responsable de su unión a PBS. Con la evidencia de la espectroscopia de fluorescencia y absorción transitoria ultrarrápida, se revelan las funciones de las bilinas individuales en la transferencia de energía. La bilina 1Iβ822 ubicada cerca del fotosistema I tiene una planaridad mejorada y es la bilina roja responsable de la transferencia directa de energía al fotosistema I.

Las cianobacterias son uno de los primeros grupos de organismos en convertir la energía solar en energía química1,2. Son los primeros organismos que crearon una transferencia lineal de electrones con dos fotosistemas, el fotosistema II (PSII) y el fotosistema I (PSI), y fueron responsables del aumento del contenido de oxígeno en la Tierra hace más de 2.400 millones de años1,2,3. Las principales antenas captadoras de luz para capturar energía solar en cianobacterias y algas rojas son los ficobilisomas (PBS)4,5,6,7, que transfieren la energía luminosa absorbida a PSII o PSI para impulsar la transferencia de electrones. PBS consta de ficobiliproteínas (PBP), que tienen pigmentos unidos covalentemente llamados bilinas, y proteínas enlazadoras4,8. Existen dos tipos de PBS en las cianobacterias, el CpcG-PBS y el CpcL-PBS. CpcG-PBS consta de dos partes: un núcleo y varillas periféricas, que están asociadas con el núcleo a través de las proteínas enlazadoras CpcG. Las estructuras crio-EM PBS determinadas recientemente a partir de algas rojas9,10 y cianobacterias11,12,13 revelaron cómo las proteínas enlazadoras y la PBP se organizan en arquitecturas de captación de luz altamente ordenadas. El CpcL-PBS tiene un tamaño mucho más pequeño y consta de una sola varilla sin núcleo de aloficocianina14,15,16. CpcL-PBS, que está unido a las membranas tilacoides a través de la proteína conectora CpcL (también llamada CpcG2 en Synechocystis 6803 y CpcG3 en Anabaena 712017), está asociada con PSI18 y es capaz de transferir la energía luminosa absorbida a PSI16,19. CpcL-PBS también participa en la formación del supercomplejo NAD(P)H-deshidrogenasa (NDH)-CpcL-PBS-PSI (NDH-PBS-PSI) para la transferencia cíclica de electrones (CEF)20 y un estudio reciente muestra que la unión de ferredoxina-NADP+ oxidorreductasa (FNR) al CpcL-PBS es necesaria para CEF21. La mayoría de los FNR de cianobacterias contienen tres dominios: dominio CpcD, dominio de unión a FAD y dominio de unión a NADPH, y el FNR de tres dominios (FNR3D) está unido a los bastones periféricos de las cianobacterias CpcG-PBS y CpcL-PBS22,23,24. Sin embargo, la unión de FNR3D a las varillas de PBS no se ha observado en las estructuras crio-EM CpcG-PBS11,12,13 determinadas recientemente. Para comprender el mecanismo de transferencia directa de energía de CpcL-PBS a PSI y su papel en la formación del supercomplejo NDH-PBS-PSI, determinamos las estructuras crio-EM de CpcL-PBS con un FNR adjunto de Synechocystis 6803. Combinado con espectroscopía de picosegundos. Como evidencia, nuestro estudio revela la naturaleza de la bilina desplazada al rojo similar a un emisor terminal y arroja luz sobre cómo CpcL-PBS podría transferir efectivamente energía luminosa dentro de PBS y a PSI en ausencia de un núcleo de PBS.

Se prepararon CpcL-PBS a partir de una cepa de Synechocystis 6803 que carece de los genes de apcAB24 y el CpcL-PBS purificado se analizó espectroscópica y bioquímicamente para determinar su composición e integridad funcional (Figura 1 complementaria). El análisis SDS-PAGE seguido de la secuenciación de la proteína N-terminal reveló que CpcL-PBS purificado contenía ficocianina (PC) y proteínas enlazadoras, incluidas CpcA, CpcB, CpcC1, CpcC2 y CpcL. La preparación de CpcL-PBS también contiene el FNR de tres dominios con una masa molecular de 45 kDa (Figura complementaria 1e). El espectro de absorción del CpcL-PBS aislado tiene una absorción máxima a 620 nm (Figura complementaria 1g), típica de una absorción de ficocianina. Su espectro de emisión de fluorescencia a temperatura ambiente tiene dos picos, uno a 648 nm y otro a 668 nm, igual que lo reportado anteriormente24,25. El pico de emisión a 648 nm es similar al hexámero de ficocianina con un conector CpcG26,27, mientras que el pico de emisión a 668 nm de la ficocianina (PC) no se ha observado en otros trímeros o varillas de PC (Figura complementaria 1g). A 77 K, se observa un pico de emisión importante a 670 nm (Figura complementaria 1h). El análisis de microscopía electrónica (EM) de tinción negativa de la muestra de CpcL-PBS muestra que contiene estructuras similares a varillas y la mayoría de las varillas contienen tres hexámeros. También se encontraron algunas partículas con más de tres hexámeros αβ (Figura complementaria 1f), lo que indica que los complejos CpcL-PBS son de naturaleza heterogénea, lo que concuerda con un trabajo anterior24. Para minimizar el desmontaje del complejo de PBS durante la preparación de la crio-rejilla, las muestras se trataron con glutaraldehído al 0,012 % y las partículas de CpcL-PBS se seleccionaron y clasificaron automáticamente (Figura complementaria 2). Se obtuvo un mapa de densidad de 2,6 Å de CpcL-PBS que contiene hexámeros de tres capas, lo que nos permitió construir modelos atómicos para todos los cromóforos (bilinas) y cadenas de proteínas (Figuras complementarias 3a-d). En particular, la arquitectura de tres capas fue la especie dominante, ya que las clasificaciones 2D y 3D no lograron enriquecer otras poblaciones. Este complejo CpcL-PBS de tres capas tiene 160 Å de longitud y 100 Å de diámetro (Fig. 1a-c). El complejo contiene 40 subunidades, incluidos 18 monómeros PC αβ (heterodímero CpcA-CpcB) y tres proteínas enlazadoras, CpcL, CpcC1 y CpcC2 en una estequiometría 1:1:1 (Fig. 1d, e). El dominio CpcD de FNR3D podría identificarse claramente en el extremo distal de CpcL-PBS (Fig. 1d, e). Los cuatro conectores están organizados en un orden de CpcL-CpcC1-CpcC2-CpcD (de FNR3D) de manera casi lineal con CpcL cerca de la membrana tilacoide y FNR3D en el extremo distal (Fig. 1d, e). CpcL-PBS se parece mucho a la varilla de CpcG-PBS de Synechocystis 680313 con un RMSD de 0,4 Å entre ellos (Fig. 1f). Estos enlazadores forman un esqueleto de enlazador que proporciona soporte para el ensamblaje de CpcL-PBS y su asociación con PSI (Fig. 1g).

a – c Vista lateral (a), vista inferior (b) y vista superior (c) del CpcL-PBS, respectivamente. α-PC, β-PC, CpcL, CpcC2 y el dominio CpcD de FNR están pintados en ciruela, azul aciano, verde bosque, cian y naranja, respectivamente. d La disposición de las proteínas enlazadoras (en presentación de cinta) dentro de CpcL-PBS. De abajo hacia arriba: CpcL, CpcC1, CpcC2 y el dominio CpcD de FNR. CpcC1 está en magenta y el otro esquema de color es el mismo que en (a–c). e Igual que (d), excepto que las proteínas enlazadoras están en una presentación de relleno y no hay fondo de PC. f Comparación estructural de la varilla CpcG (PDB 7SC8) 13 y CpcL-PBS. g Presentación esquemática de CpcL-PBS y PSI en la membrana tilacoide con los hexámeros de PC en azul y el complejo PSI en verde bosque. Los dos dominios que ocupan las cavidades centrales de los hexámeros: Pfam00427 (rectángulos verticales) y Pfam01383 (rectángulos horizontales). Los trímeros de PC están numerados de abajo hacia arriba de forma secuencial.

El dominio Pfam00427 de CpcL estaba ubicado en la cavidad del hexámero inferior de CpcL-PBS, el hexámero proximal a la membrana. La región transmembrana de CpcL, que se predijo que anclaría CpcL-PBS a las membranas tilacoides15, no se resolvió probablemente debido a su movimiento irrestricto en los complejos purificados. Al igual que las proteínas CpcC en las algas rojas9,10 y otras cianobacterias11,12,13, tanto CpcC1 como CpcC2 de Synechocystis 6803 tienen dos dominios estructurales, Pfam00427 en el extremo N y Pfam01383 en el extremo C. El dominio Pfam01383 de CpcC1 interactúa con los dominios Pfam00427 de CpcL mientras que el dominio Pfam01383 de CpcC2 interactúa con los dominios Pfam00427 de CpcC1. La unión de CpcC1 a CpcL está mediada por una interfaz extensa, que involucra el bucle N-terminal largo (G219-G233, LoopC1), el bucle entre β1 y β2 (I253-K259, Loop12) y la hélice 9 (α9) de el dominio Pfam01383 de CpcC1. Estos dos bucles se pliegan hacia CpcL e interactúan desde dos lados opuestos. Esta interfaz estrecha está mediada por una gran cantidad de residuos de CpcC1 y CpcL, incluidas cadenas laterales polares e hidrofóbicas (Fig. 2a, b). La alineación de secuencias de CpcC1 y CpcC2 muestra que, si bien las secuencias generales de las dos proteínas son muy similares entre sí, algunos residuos de CpcC1 involucrados en las interacciones con CpcL no se conservan en CpcC2 (Figura complementaria 4a). La superposición de los dominios Pfam01383 de CpcC1 y CpcC2 (Fig. 2b) muestra que CpcC1 podría tener una interacción más óptima con CpcL que CpcC2 debido a las distintas conformaciones de ellos en las dos regiones de bucle mencionadas anteriormente. De hecho, la comparación de secuencias muestra que CpcC1 tiene un conector de dominio más largo (16 residuos más) que CpcC2, que está aguas arriba de uno de los bucles que interactúan con CpcL (Figura complementaria 4a). Esta diferencia de diálogo también debería contribuir a la preferencia de CpcL por CpcC1. En la estructura CpcL-PBS, la interacción del dominio Pfam01383 de CpcC2 con el dominio Pfam00427 de CpcC1 en CpcL-PBS es la misma que en los bastones periféricos de CpcG-PBS11,12,13. Estructuralmente, debido a un enlazador entre dominios más corto, los dos dominios de CpcC2 están orientados de manera diferente en comparación con el de CpcC1: se ve que el dominio Pfam01383 en CpcC2 tiene una rotación de 250 ° (Figura complementaria 4b), lo que lleva a una rotación ligeramente desviada. -posición axial del hexámero medio de CpcL-PBS (Fig. 1a).

a Interacción de CpcC1 (magenta) con CpcL (verde bosque). La vista inferior de CpcC1 (panel superior) y la vista superior de CpcL (panel inferior) muestran la distribución espacial de los residuos que participan en las interacciones hidrofóbicas y los enlaces de hidrógeno. LoopC1: el bucle cercano a β1 de CpcC1. Loop12: el bucle entre β1 y β2 de CpcC1. b Interacciones detalladas entre CpcC1 (magenta) y CpcL (verde bosque) con la misma región de CpcC2 (cian) superpuesta a CpcC1. El panel inferior muestra las mismas estructuras que se muestran en el panel superior con una rotación de 180 grados. c Interacción general del dominio Pfam01383 (CpcD) de FNR (naranja) con el dominio Pfam00427 de CpcC2 (cian). d Se muestra el área de interfaz de CpcC2 con los residuos relevantes. e – g Tres áreas representativas de interacciones entre el dominio CpcD de FNR y Pfam00427 de CpcC2. Las distancias están en angstrom.

En el extremo distal de la membrana de CpcL-PBS, el dominio CpcD de FNR3D se identifica inequívocamente e interactúa con Pfam00427 de CpcC2 principalmente mediante interacciones polares (Fig. 2c-g). Esta base estructural de la unión del dominio CpcD de FNR3D al dominio Pfam00427 de una proteína CpcC en un hexámero de PC es importante para nuestra comprensión del papel de CpcL-PBS en la formación del supercomplejo NDH-PSI-PBS y en el flujo cíclico de electrones28,29. 30,31. Las estructuras de los otros dos dominios de FNR3D en CpcL-PBS no se pudieron determinar debido a la larga y flexible región enlazadora entre dominios21,22. Notamos que la proteína CpcD ubicada en los extremos distales de las varillas periféricas de CpcG-PBS de Synechocystis 680313 y el dominio CpcD de FNR3D poseen un patrón de unión similar con el dominio Pfam00427 de CpcC2 (Figura complementaria 5). Por lo tanto, se necesitan más estudios para comprender por qué no se observa FNR3D en las varillas periféricas de las estructuras crio-EM de CpcG-PBS.

La distribución general de bilinas en CpcL-PBS es la misma que la de una varilla periférica en CpcG-PBS11,12 (Fig. 3a) y las bilinas están en estrecho contacto con las proteínas enlazadoras (Fig. 3b). Se ha sugerido que la interacción proteína-bilina juega un papel crucial en la transferencia de energía unidireccional dentro de las barras de CpcG-PBS11, pero hasta ahora no se han examinado cuidadosamente las conformaciones de bilina en las barras en PBS intacto. Debido a que el CpcL-PBS reportado aquí y por Liu et al.24 tiene un pico de emisión de fluorescencia a temperatura ambiente de 668 nm, que está significativamente desplazado al rojo que el de cualquier varilla de PC relacionada con CpcG26,27, proporciona un sistema excelente para comprender el mecanismo estructural de transferencia de energía dentro de las varillas de PBS y a PSI. La alta resolución de la estructura crio-EM CpcL-PBS nos permite comparar los cambios de conformación de bilina provocados por las interacciones proteína-bilina, que se han observado en el emisor terminal ApcD32 y las ficobiliproteínas de especies adaptadas a la luz roja lejana33.

a Distribución general de bilinas en CpcL-PBS con las bilinas 1Iβ821, 1Iβ822, 1Iβ823 y 1IIβ821 resaltadas en rosa. b La relación espacial entre las proteínas enlazadoras (CpcL y CpcC1) y las bilinas resaltadas en cuadrados. c La conformación de las bilinas de CpcL-PBS o CpcG-PBS de Synechocystis 6803. De arriba a abajo: 1Iβ821, 1Iβ822, 1Iβ823 y 2IIβ823 de CpcL, 1Iβ821G (G indica que la bilina es de CpcG-PBS) y 1Iβ822G. de la varilla periférica1, y la bilina α84 del emisor terminal ApcD del núcleo de CpcG-PBS. Las coordenadas de bilinas de CpcG-PBS de Synechocystis 6803 provienen de un estudio crio-EM reciente13. d Presentación esquemática de bilines de los anillos A al D en el panel (c). Se muestran los ángulos entre los planos de pirrol adyacentes.

Todas las bilinas en CpcL-PBS son ficocianinbilina (PCB), que es un tetrapirrol de cadena abierta unido covalentemente a PC en el anillo A. La conformación de una bilina está definida por los planos de sus cuatro anillos de pirrol y los tres ángulos entre los anillos. Se compilan siete bilinas representativas diferentes, cuatro de CpcL-PBS y tres de CpcG-PBS, para comparación conformacional (Fig. 3c, d y Fig. complementaria 3e-h). La mayoría de las bilinas en CpcL-PBS tienen una conformación como la bilina 2IIβ823 (Fig. 3c, d y Fig. complementaria 3h): el ángulo entre los anillos A y B está entre 26 ° -30 °; el ángulo entre los anillos B y C es inferior a 10°; el ángulo entre los anillos C y D es mayor que 35°. Para las tres bilinas β82 en el trímero inferior de CpcL-PBS, las conformaciones son diferentes de las de 2IIβ823: los ángulos entre los anillos C y D se reducen significativamente, lo que indica que la planaridad de estas bilinas aumenta considerablemente. Debido a que el anillo A en estas tres bilinas está cerca de su β-PC y lejos de los residuos de CpcL, los ángulos entre el anillo A y el anillo B permanecen casi inalterados. La bilina más aplanada en CpcL-PBS es 1Iβ822. Sus ángulos entre los anillos A y B, B y C, y C y D son 26 °, 7 ° y 8 °, respectivamente (Fig. 3c, d y Fig. complementaria 3f). El emisor terminal ApcD tiene un pico de emisión de fluorescencia a 680 nm y sus anillos B, C y D son casi coplanares con los tres ángulos respectivos de 25 °, 7 ° y 2 °, respectivamente (Fig. 3c, d). Por lo tanto, se espera que la bilina 1Iβ822 tenga un desplazamiento hacia el rojo significativo en los picos de absorción y emisión de fluorescencia. Las bilinas 1Iβ821 y 1Iβ823 son menores pero aún significativamente aplanadas y los ángulos entre los anillos C y D son 21° en 1Iβ821 y 25° en 1Iβ823. Dado que la bilina 1Iβ821 tiene una interacción extensa con CpcL (Fig. 3b), se espera que tenga un desplazamiento al rojo significativo en la absorción y la emisión de fluorescencia. Los bilins aplanados reportados aquí no se limitan a CpcL-PBS. La bilina 1Iβ821G (“G” para CpcG) de la varilla periférica de Synechocystis CpcG-PBS, que es equivalente a la bilina 1Iβ821 de CpcL-PBS, tiene los tres ángulos respectivos de 30°, 11° y 15°, muy similares. al de la bilina 1Iβ821 de CpcL-PBS (Fig. 3d y Fig. complementaria 3e). El bilin 1Iβ822G, que es equivalente al bilin 1Iβ822 en posición, tiene los tres ángulos respectivos de 32 °, 10 ° y 20 °, significativamente menos aplanados que el 1Iβ822 de CpcL-PBS (Fig. 3c, d). La bilina 1Iβ821G de CpcG-PBS es probablemente la trampa de energía de las varillas periféricas para la transferencia de energía de las varillas al núcleo11, mientras que 1Iβ822 de CpcL-PBS es candidata como trampa para la transferencia de energía de CpcL-PBS a PSI.

Cada monómero αβ de CpcL-PBS tiene tres cromóforos unidos covalentemente, uno en la subunidad α (α84) y dos en las subunidades β (β82 y β152), similares a los monómeros αβ de PC de los bastones periféricos de CpcG-PBS4. Ubicado en el centro del hexámero de PC cerca de la membrana tilacoide, CpcL está cerca de cuatro bilinas e interactúa ampliamente con las tres bilinas β82 inferiores (1Iβ821, 1Iβ822 y 1Iβ823) (Fig. 3b). Los estudios espectroscópicos han demostrado que las bilinas β82, que se encuentran en el interior de los anillos del trímero de PC, funcionan como aceptoras de excitones, mientras que las otras dos bilinas de un trímero de PC actúan como donantes4. Cuando los trímeros de PC forman varillas de PBS con la ayuda de proteínas enlazadoras, especialmente el enlazador CpcG, la emisión de fluorescencia se desplaza al rojo26,27, lo que sugiere que los enlazadores podrían modular el estado energético de las bilinas. Las estructuras crio-EM de CpcG-PBS cianobacteriano muestran que el conector CpcG proporciona residuos aromáticos que rodean la bilina 1Iβ821, que transfiere la energía luminosa absorbida desde las varillas a los núcleos de PBS11.

La comparación de los residuos circundantes de la bilina 1Iβ821 de la varilla CpcG-PBS y CpcL-PBS muestra que se pueden observar más interacciones entre la bilina 1Iβ821 y CpcL que entre la bilina 1Iβ821G y CpcG (Fig. 4a, b y Fig. 6a complementaria). ), y las interacciones de la bilina 1Iβ821 con CpcG y CpcL son ligeramente diferentes, especialmente en las proximidades del anillo D (Figura complementaria 6a). La alineación de secuencia también revela la divergencia de los residuos alrededor del anillo D, como Q57 y R178 de CpcL (Figura complementaria 6d). Tres residuos de arginina cargados positivamente (R178, R112 y R181) de CpcL están a 4 Å de la bilina 1Iβ821 (Fig. 4b y Fig. Suplementaria 6a), e interactúan con los grupos de ácido carboxílico en los anillos B y C o con los oxígeno en el anillo D. Además, N55, Q57, Q58 e Y182 son capaces de formar enlaces de hidrógeno con los átomos de nitrógeno u oxígeno de 1Iβ821 (Fig. 4b y Figs. complementarias 6a, 7a). La interacción entre bilina 1Iβ823 y CpcL también es extensa e involucra tres residuos de arginina (R16, R163 y R169) (Fig. 4c y Figs. Suplementarias 6b, 7c). Por el contrario, las interacciones entre CpcL y 1Iβ822 no involucran ningún residuo de arginina (Fig. 4d y Figs. Suplementarias 6c, 7b). Los residuos de CpcG que interactúan con 1Iβ822 y 1Iβ823 están altamente conservados o son invariantes en CpcL (Fig. 6b, c complementaria).

a – d Vista inferior de CpcL-PBS, que muestra el CpcL (verde) y las tres bilinas β82, 1Iβ821 (cuadrado b), 1Iβ822 (cuadrado c) y 1Iβ822 (cuadrado d), de CpcL-PBS. Interacción de residuos de aminoácidos clave de CpcL (verde) con 1Iβ821 (panel b), 1Iβ822 (panel c) y 1Iβ823 (panel d). Las bilinas (tetrapirrol de cadena abierta) están en rosa con los cuatro anillos de pirrol etiquetados de la A a la D. Los átomos de oxígeno están en rojo, los átomos de nitrógeno están en azul. Las líneas discontinuas indican interacciones y las distancias entre los átomos están en Angstroms. e Comparación estructural de bilina 1Iβ822 de la varilla CpcG-PBS (PDB 7SC8) 13 y CpcL-PBS. La alineación se realizó con la subunidad CpcB como referencia, y el RMSD de todos los átomos que no son de hidrógeno en el anillo D es de 0,5 Å entre dos bilinas. f Comparación estructural de los complejos CpcG-CpcB (PDB 7SC8) y CpcL-CpcB alineando su subunidad CpcB. El entorno alrededor de la bilina 1Iβ822 está resaltado en un cuadro rectangular marrón sólido. g Vista ampliada del entorno alrededor de bilin 1Iβ822. La diferencia entre CpcL y CpcG radica en las hélices α6 y α7. h Una vista rotada 45° de (g). Se resalta en rojo la distancia entre los residuos que regulan la conformación de su bilina 1Iβ822. i Residuos que se encargan de modular la conformación de esta región α6-α7.

El CpcL-PBS tiene picos de emisión de fluorescencia a 648 nm y 668 nm a temperatura ambiente24,25 (Figura complementaria 1g), el primero está en la misma posición de las varillas de PC aisladas con conectores, mientras que el segundo tiene un desplazamiento significativamente al rojo en comparación. a cualquier emisión de fluorescencia de PC. Como se mencionó anteriormente, la bilina 1Iβ822 pero no la 1Iβ821 puede explicar el corrimiento al rojo de la emisión de fluorescencia, ya que la bilina 1Iβ822 es la que más se aplana en CpcL-PBS. El entorno de la bilina 1Iβ822 proporcionada por β-PC es el mismo en las varillas de CpcG-PBS y CpcL-PBS (Fig. 7b complementaria), la diferencia en la conformación de bilina (Fig. 3c, d) entre las bilinas 1Iβ822 de CpcG-PBS y CpcL-PBS probablemente se genera por una diferencia sutil de su entorno creada por CpcG o CpcL. Curiosamente, los residuos clave que participan en la interacción de las bilinas 1Iβ822 con CpcG y CpcL son idénticos (Fig. 4d y Fig. complementaria 6c). La superposición de los dos bilins utilizando la subunidad CpcB como referencia de alineación revela un RMSD de 0,5 Å para el anillo D de los bilins y una rotación aparente para el anillo D (~ 10 °) (Fig. 4e). En comparación con CpcG, no se observó ninguna diferencia significativa en CpcL excepto por una región de dos hélices conectadas junto a 1Iβ822 (α6 y α7) (Fig. 4f). De hecho, el α6 de CpcG o CpcL y el α6 de CpcB sujetan la bilina 1Iβ822 y deberían poder modular la conformación del anillo D (Fig. 4g, h). En esta región, una diferencia importante es entre el I129 de CpcL y el I127 de CpcG. Ambos residuos están ubicados junto al anillo D de 1Iβ822 en sus respectivas estructuras de PBS (Figura complementaria 7b), pero I129 de CpcL en CpcL-PBS tiene un desplazamiento de ~ 0,6 Å hacia el anillo D en comparación con I127 de CpcG en CpcG- PBS (Figuras 4g, h). En esta región de giro helicoidal (W125-L141 de CpcG y W127-L143 de CpcL), algunos residuos difieren en identidad entre CpcL y CpcG, incluidos L136, P137 y F139 de CpcL (Fig. 4i y Fig. Suplementaria 6d). Estos residuos están ubicados en la región de giro de las dos hélices, y sus posiciones equivalentes en CpcG son Y134, Q135 y L137, respectivamente (Fig. 4i). Aparentemente, estas diferencias de secuencia (Figura complementaria 6d), especialmente una prolina P137 en CpcL, generan diferencias conformacionales locales que impactan en la orientación de α6, que a su vez modula la conformación de la bilina 1Iβ822. Por lo tanto, sugerimos que estos residuos clave en CpcL son responsables de proporcionar una restricción espacial en la bilina, lo que lleva a una rotación del anillo D y una reducción del ángulo entre los anillos C y D.

El CpcL se extiende hacia la mitad superior del hexámero inferior de CpcL-PBS e interactúa con las bilinas en la segunda capa trímera. Por ejemplo, S70 y Q71 de CpcL podrían formar enlaces de hidrógeno con el anillo D, mientras que K73 podría formar enlaces de hidrógeno con el anillo C de 1IIβ821 (Figura complementaria 8). Además de CpcL, las proteínas enlazadoras CpcC1, CpcC2 y el dominio CpcD de FNR también participan en interacciones con bilinas dentro de CpcL-PBS (Figura complementaria 8) y estas interacciones podrían ser importantes para la estabilización de bilina y la transferencia de energía.

Se ha utilizado espectroscopia de fluorescencia ultrarrápida para estudiar la transferencia de energía dentro de CpcL-PBS de Synechocystis 680325 y la transferencia de energía de CpcL-PBS a PSI de Anabaena 712034, y ambos estudios revelaron la importancia de la especie "PCB roja" de CpcL-PBS en la transferencia de energía. . Para comprender la dinámica de transferencia de energía, la migración de excitones entre las bilinas de CpcL-PBS y la identidad del PCB rojo, se realizó espectroscopia de absorción transitoria resuelta en tiempo de femtosegundos con CpcL-PBS intacto (Fig. 5a-c). En la configuración experimental de absorción transitoria, la longitud de onda de excitación se fijó en 590 nm con una duración de pulso de 100 fs. Los espectros de absorción transitoria adquiridos con diferentes retardos de tiempo se presentan en la Fig. 5a. Tanto el blanqueo del estado fundamental como la emisión estimulada contribuyeron a la absorción negativa, mientras que la absorción transitoria debido al estado excitado de las bilinas condujo a un cambio de absorbancia positivo. Se obtienen cuatro componentes de desintegración con diferentes constantes de tiempo (Fig. 5b) mediante el análisis global de los espectros. El componente rápido P1 con un tiempo de caída de 3,6 ps tiene un blanqueo por absorción a 631 nm y un pico de absorción positivo a 671 nm; el segundo componente rápido P2 tiene blanqueo por absorción a 637 nm y una absorción positiva a 675 nm. Los componentes RS y RL tienen un tiempo de desintegración intermedio de 200 ps y su blanqueo por absorción es a 644 nm y 668 nm, respectivamente. El componente lento T con un tiempo de desintegración de >1200 ps tiene un blanqueo por absorción a 669 nm. El análisis de la dinámica global muestra que la migración de energía dentro de CpcL-PBS ocurre de forma secuencial y en un rango de tiempo de picosegundos (Fig. 5c):

Aquí el componente T es el PCB rojo que tiene un blanqueamiento fotoinducido a 669 nm y una constante de tiempo de descomposición larga.

a Espectros de absorción transitoria resueltos en el tiempo en femtosegundos entre 550 nm y 700 nm. La longitud de onda de excitación se establece en 590 nm y la duración del pulso del láser de excitación es de 100 fs. Se muestran seis espectros resueltos en el tiempo de 100 fs, 1 ps, 10 ps, 20 ps, 200 ps y >1200 ps. b Se obtienen cuatro espectros de absorción asociados a especies (SAS) a partir del análisis global de los espectros de absorción transitoria: P1 (3,6 ps), P2, (40 ps), RS (200 ps), RL (200 ps) y T (> 1200 ps) y su blanqueo es a 631 nm, 637 nm, 644 nm, 668 y 669 nm, respectivamente. c Cinética de los cuatro componentes correspondientes asociados a especies. d Espectros de fluorescencia diferenciales (DAS) asociados a la dinámica de CpcL-PBS excitados a 565 nm; La fluorescencia se registra con una cámara de rayas. e Espectros de emisión asociados a especies (SAS) de CpcL-PBS. Se muestran las longitudes de onda máximas de cada componente. f Cinética de los tres componentes de descomposición asociados a especies correspondientes.

La transferencia de energía de CpcL-PBS se estudia más a fondo mediante espectroscopia de fluorescencia resuelta en el tiempo de picosegundos (Fig. 5d-f). Los mapas 2D de longitud de onda de tiempo de CpcL-PBS excitados a 565 nm se obtuvieron en diferentes rangos de tiempo (Figura 9 complementaria) y se realizó un análisis global de los espectros de fluorescencia adquiridos resueltos en el tiempo. Los espectros asociados a la desintegración (DAS) y los espectros asociados a especies (SAS) se presentan en la Fig. 5d y la Fig. 5e, respectivamente. Se obtuvieron tres espectros asociados a especies con su respectiva constante de tiempo de desintegración de 101 ps, 401 ps y 1999 ps y el SAS con una constante de tiempo de 401 ps está compuesto por dos componentes, uno con un pico a 651 nm y el otro a 669 nm. La dinámica de estos componentes en la transferencia de energía (Fig. 5f) confirma el siguiente esquema de transferencia de energía:

Con la determinación de la estructura crio-EM de CpcL-PBS y de los componentes en la transferencia de energía mediante espectroscopia ultrarrápida, se deduce el proceso de transferencia de energía de un PCB normal al "PCB rojo" dentro de CpcL-PBS. En los espectros de absorción transitoria resueltos en el tiempo en femtosegundos, el componente de desintegración más rápido P1 tiene un pico de blanqueo a 631 nm y se asigna a las bilinas PCB α84 y β155, ya que estas bilinas tienen poca interacción con las proteínas enlazadoras y se espera que tengan el blanqueo de absorción más corto. longitudes de onda. El componente P2 tiene un pico de blanqueo a 637 nm y está asignado a todos los PCB β82 excepto a las tres bilinas ubicadas en el trímero inferior de la PC. Estas bilinas, ubicadas dentro de las cavidades de los hexámeros, interactúan con las proteínas enlazadoras (Fig. 4 y Fig. complementaria 7) y se espera que su blanqueo por absorción sea un corrimiento al rojo26,27. El componente RS se asigna a la bilina 1Iβ823 porque tiene una planaridad mejorada (Fig. 3) e interactúa con CpcL (Fig. 4 y Fig. 6 complementaria). Los componentes RL y RS tienen la misma constante de desintegración de 200 ps, pero RL tiene un blanqueo de absorción significativamente desplazado al rojo a 668 nm. La bilina 1Iβ821 tiene una planaridad mejorada similar a la de 1Iβ821G, pero interactúa más con la proteína conectora que 1Iβ821G o 1Iβ823 (Fig. 4 y Fig. 6 complementaria). Por lo tanto, RL se asigna provisionalmente a 1Iβ821. Debido a que la bilina 1Iβ822 tiene la planaridad más mejorada y una interacción extensa con CpcL, el componente T se asigna a 1Iβ822, el PCB rojo de CpcL-PBS. En los espectros de fluorescencia de picosegundos, la emisión de fluorescencia de todos los PCB, excepto las tres bilinas 1Iβ82, se fusionó como el espectro de C645nm (100 ps); las bilinas 1Iβ823(RS), 1Iβ821, (RL) dan lugar a los espectros de C651nm/C669nm (401 ps); y la bilina 1Iβ822 (T) dan lugar al espectro de C672nm (1999 ps). La estructura y el espectro de emisión de fluorescencia resuelta en el tiempo de la bilina 1Iβ822 (componente T) tiene caracteres especiales de PCB rojo como la bilina α84 en ApcD35, lo que demuestra claramente aquí que CpcL-PBS tiene características estructurales para la formación de un emisor terminal. como PCB rojo para transferencia directa de energía a PSI. Nuestro estudio también arrojó luz sobre los mecanismos de transferencia de energía en otros tipos de PBS que se encuentran en algas rojas y cianobacterias, incluida Acaryochloris sp.36.

La cepa de tipo salvaje de Synechocystis sp. PCC 6803 (Synechocystis 6803) y su cepa mutante se cultivan en medio BG11 a 25 °C con una intensidad de luz de 50 μmol de fotones m-2 s-1. El medio para el crecimiento de la cepa mutante se complementó con 10 μg ml-1 de eritromicina y glucosa 10 mM. Los cultivos se burbujearon suavemente con aire más 1% de CO2.

La cepa mutante ΔapcAB se construyó como se describe en Ajlani et al.38 con algunas modificaciones. La región aguas arriba y aguas abajo del gen apcAB y un fragmento de ADN que codifica un gen resistente a la eritromicina se amplificaron mediante reacción en cadena de la polimerasa (PCR) utilizando pares de cebadores P1/P2, P3/P4 y P5/P6, respectivamente (Tabla complementaria 1). . Las secuencias anteriores se ligaron mediante PCR de fusión. Los productos de PCR resultantes se transformaron en la cepa Synechocystis 6803 de tipo salvaje. La segregación del mutante ΔapcAB se verificó mediante PCR.

CpcL-PBS se aisló de la cepa mutante ΔapcAB según Liu et al.24, o con algunas modificaciones como se muestra a continuación. Todas las operaciones se realizaron a 22 °C. Brevemente, las células se rompieron en tampón K/Na-PO4 0,75 M a pH 7,0 con fluoruro de fenilmetilsulfonilo 1 mM pasándolas tres veces a través de una prensa francesa a 7000 psi. Después de 0,5 h de incubación con n-dodecil-β-d-maltósido (DDM) al 0,5% (p/v), las muestras se centrifugaron a 20.000 x g. El sobrenadante se cargó inmediatamente en un gradiente de sacarosa. Los gradientes de sacarosa se prepararon a partir del tampón A (tampón K/Na-PO4 0,75 M, glutaraldehído al 0,0125 % (p/v), β-DDM al 0,03 % (p/v), pH 7,0) añadiendo sacarosa a estas concentraciones: 0,4, 0,55. , 0,7, 0,85, 1,0 y 1,5 M. Las muestras se centrifugaron a 370.000 × g durante 16 h utilizando un rotor TLA110 en una centrífuga Beckman Optima MAX-XP. Se recogieron muestras de CpcL-PBS en la interfaz de sacarosa de 0,85 M a 1,0 M. La sacarosa de las muestras de CpcL-PBS purificadas se eliminó mediante ultrafiltración con filtros centrífugos Millipore de 30 kD. Los espectros de absorción y los espectros de emisión de fluorescencia se obtuvieron como se describió anteriormente11.

Antes de preparar rejillas para crio-EM, las muestras de CpcL-PBS se concentraron a ~0,75 mg ml-1. Se cargaron alícuotas (3,5 μl) de muestras en rejillas de cobre de películas de carbono perforadas con descarga luminosa (20 s) (Quantifoil R1.2/1.3, membrana C de +2 nm, malla Cu 300) y se esperaron 60 s. Luego se agregaron dos veces a la rejilla una alícuota de 3,5 µl de un tampón (Tris 50 mM, pH 7,0, β-DDM al 0,01 % (p/v)) y se mezclaron inmediatamente con la muestra antes de la vitrificación (para diluir la alta concentración de sales de fosfato). Después de secar durante 2 s, la rejilla se sumergió en etano líquido con un FEI Vitrobot Mark IV (18 °C y 100 % de humedad). Las crio-redes se probaron por primera vez en un Talos Arctica operado a 200 kV (equipado con una cámara FEI CETA). Se transfirieron redes de buena calidad a un FEI Titan Krios operado a 300 kV con un detector de electrones directo Gatan BioQuantum GIF/K3 para la recopilación de datos.

Las películas se grabaron con un detector de electrones directo BioQuantum GIF/K3 (Gatan) en el modo de superresolución con un aumento nominal de ×81.000, con una tasa de exposición de 17,9 e−/Å2 por segundo utilizando el software EPU 2. Al final del detector se utilizó un filtro de energía GIF Quantum (Gatan), con un ancho de rendija de 20 eV. El rango de desenfoque se estableció entre −1,0 y −1,8 μm. El tiempo total de exposición fue de 3,84 s y se adquirieron 32 fotogramas por imagen con una exposición total de electrones de ~60 e-/Å2. Las estadísticas para la recopilación de datos se resumen en la Tabla complementaria 2.

Para determinar la estructura 3D del complejo CpcL-PBS, se grabaron dos lotes de pilas de películas. Los fotogramas de película sin procesar se alinearon y promediaron en imágenes sumadas con corrección de movimiento con un tamaño de píxel de 1,07 Å mediante MotionCor239. Se utilizó el programa Gctf (v1.06)40 para estimar los parámetros de la función de transferencia de contraste (CTF) de cada imagen con corrección de movimiento. Todo el procesamiento de datos siguiente se realizó con Relion-3.141. Se recogieron manualmente 1.350 partículas y se sometieron a clasificación 2D para generar plantillas para la recogida automática de partículas. Luego se realizó una selección automática de las imágenes que se seleccionaron manualmente para el tratamiento. Las partículas seleccionadas se sometieron a una ronda de clasificación 2D y se seleccionaron partículas de alta calidad para clasificaciones 3D posteriores. El modelo inicial se generó a partir de estas partículas. Después de múltiples rondas de clasificación 3D, se seleccionaron partículas relativamente homogéneas para el refinamiento 3D, lo que dio como resultado un mapa con una resolución general de 2,64 Å después del posprocesamiento basado en máscaras, según el criterio estándar de oro FSC 0,143. El mapa de resolución local se analizó utilizando ResMap42 y se mostró utilizando UCSF Chimera43. El flujo de trabajo del procesamiento de datos se ilustra en la figura complementaria 2.

La estructura cristalina de un monómero PC αβ de Synechocystis 6803 (código PDB 4F0T)44 se utilizó como plantilla inicial para el modelado de hexámeros de PC. Los modelos atómicos de CpcL, CpcC1, CpcC2 y PetH se adoptaron de las bases de datos AlphaFold45. Todas las estructuras se acoplaron primero al mapa de densidad utilizando UCSF chimera43 y luego se ajustaron manualmente en COOT46. Los modelos atómicos finales se refinaron en el espacio real utilizando PHENIX47 con estructuras secundarias y restricciones geométricas aplicadas. Los modelos atómicos finales se evaluaron utilizando Molprobity48 y las estadísticas de recopilación de datos y validación del modelo se incluyeron en la Tabla complementaria 2.

Los detalles de la configuración de espectroscopia de absorción ultrarrápida construida en casa se han descrito en otro lugar49. Brevemente, un láser de Ti:zafiro (Hurricane, Spectra-Physics, EE. UU.) entregó pulsos de 100 fs (FWHM) en una longitud de onda central de 800 nm a una velocidad de repetición de 1 kHz. Luego, los pulsos se dividieron en dos haces usando un divisor de haz: uno se usó para generar una luz blanca supercontinua que se usó como luz de sonda. El otro se utilizó para bombear un amplificador paramétrico óptico no colineal (NOPA) de fabricación casera para generar una fuente de excitación de longitud de onda sintonizable en la región visible. En el experimento actual, la longitud de onda de excitación se fijó en 590 nm. La energía de excitación fue de aproximadamente 10 nJ por pulso con un tamaño de punto de aproximadamente 120 μm. La polarización relativa de los impulsos de la bomba y de la sonda se fijó en el ángulo mágico. La muestra se colocó en una celda de flujo de sílice fundida de 1 mm de espesor para evitar daños a la muestra; la densidad óptica (OD) de la muestra se estableció en 0,26 en su longitud de onda de máxima absorción a 620 nm. La cinética de desintegración se escaneó con una resolución temporal de 0,02 ps por paso en la etapa inicial, mientras que en la etapa posterior se utilizaron pasos de retardo de tiempo variados y mayores. Los datos espectrales de absorción de diferencia resueltos en el tiempo se promediaron más de 30 veces para obtener una mejor relación señal-ruido.

Para las mediciones de fluorescencia resueltas en el tiempo, la muestra se colocó en una cubeta de sílice fundida de 1 mm de espesor con una densidad óptica de 0,24 a 620 nm. El amplificador de femtosegundo (Spectra Physics, EE. UU.) entregó pulsos de 100 fs a una frecuencia de repetición de 5 kHz. La longitud de onda de excitación se fijó en 565 nm desde un sistema de amplificación paramétrica óptica sintonizable comercializado (TOPAS, Spectra Physics) bombeado por el amplificador de femtosegundo. Se utilizó energía de pulso de 5 nJ por pulso con un tamaño de punto de ~200 μm para excitar la muestra. Se utilizó un filtro de banda de paso largo de 600 nm de alta calidad para bloquear el pulso de excitación residual. La luz fluorescente emitida se recogió y se enfocó en un espectrógrafo y se midió con una cámara de racha 5200 (XIOPM, China) que operaba a rangos de escaneo de 1,4 ns o 5 ns con una resolución de tiempo de ~30 ps o ~200 ps, respectivamente. La ventana espectral registrada por el CCD de la cámara de rayas fue de 260 nm en las mediciones, cubriendo la longitud de onda de fluorescencia de la muestra. Los datos de fluorescencia resueltos en el tiempo se promediaron en 10 mediciones individuales.

Se utilizó un ajuste global para resolver los componentes espectrales individuales del espectro congestionado. El programa fue implementado en base a LabView. Empleamos el método de descomposición en valores singulares (SVD) según el informe anterior49. DAS (espectros diferentes asociados a la dinámica) es un espectro diferencial cinético-dependiente que se puede obtener directamente a partir del ajuste global. Los espectros de emisión asociados a especies (SAS) y la cinética correspondiente podrían resolverse estableciendo un modelo basado en el resultado del DAS, ya que el SAS está determinado por el modelo analítico que hayamos elegido. Aquí primero obtuvimos la vida útil de cada componente de DAS, y luego atribuimos cada proceso a los pigmentos correspondientes involucrados en el modelo de transferencia de energía basado en las moléculas de pigmento resueltas en la estructura crio-EM:

Se pueden encontrar más detalles sobre la adaptación global en nuestras publicaciones anteriores50.

Más información sobre el diseño de la investigación está disponible en el Resumen del informe de Nature Portfolio vinculado a este artículo.

Los datos que respaldan este estudio están disponibles a pedido de los autores correspondientes. La coordenada atómica de la estructura CpcL-PBS se ha depositado en Protein Data (PDB) con el siguiente código de acceso 8HFQ (CpcL-PBS). El mapa crio-EM correspondiente se ha depositado en el Banco de datos de microscopía electrónica (EMDB) con el siguiente número de acceso EMD-34724 (CpcL-PBS). Se puede acceder a las estructuras publicadas anteriormente de la varilla de CpcG-PBS de Synechocystis 6803 mediante el código de acceso 7SC8. Las figuras complementarias 1e, f se proporcionan como archivo de datos de origen. Los datos originales se proporcionan con este documento.

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Mao, P., Wang, Z., Dang, W. & Weng, Y. Espectroscopia de amplificación paramétrica óptica no colineal de fluorescencia resuelta en el tiempo de femtosegundos asistida por amplificador de bloqueo multicanal con rechazo eficiente del fondo de superfluorescencia. Rev. Ciencia. Instrumento. 86, 123113 (2015).

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Agradecemos a las instalaciones centrales de la Facultad de Ciencias de la Vida de la Universidad de Pekín por su ayuda con la microscopía electrónica de tinción negativa; el Centro Nacional de Ciencias de las Proteínas de la Universidad de Pekín por su ayuda con la preparación de muestras; la Plataforma Cryo-EM y el Laboratorio de Microscopía Electrónica de la Universidad de Pekín para la recopilación de datos crio-EM; la Plataforma de Computación de Alto Rendimiento de la Universidad de Pekín para obtener ayuda con la computación. Este trabajo fue apoyado por la Fundación Nacional de Ciencias de China (22027802 para YW, 32070203 y 91851118 para JZ, 32270253 para ZGZ), el Ministerio de Ciencia y Tecnología de China (2017YFA0503703 para JZ) y el Fondo de Innovación Qidong-SLS para NG

Estos autores contribuyeron igualmente: Lvqin Zheng, Zhengdong Zhang, Hongrui Wang, Zhenggao Zheng.

Facultad de Ciencias de la Vida, Universidad de Pekín, Beijing, 100871, China

Lvqin Zheng, Zhengdong Zhang, Hongrui Wang, Zhenggao Zheng, Chunxia Dong, Guopeng Wang, Ning Gao y Jindong Zhao

Laboratorio Estatal Clave de Biología de Membranas, Universidad de Pekín, Beijing, 100871, China

Lvqin Zheng y Ning Gao

Laboratorio Estatal Clave de Investigación de Proteínas y Genes Vegetales, Universidad de Pekín, Beijing, 100871, China

Zhengdong Zhang, Hongrui Wang, Zhenggao Zheng, Chunxia Dong y Jindong Zhao

Laboratorio de Física de Materia Blanda, Instituto de Física, Academia China de Ciencias, Beijing, 100190, China

Jiayu Wang, Heyuan Liu, Hailong Chen y Yuxiang Weng

También puedes buscar este autor en PubMed Google Scholar.

NG, YW y JZ concibieron el proyecto y diseñaron el experimento; Mutante construido ZDZ, ZGZ y CD; ZDZ, HW y ZGZ aislaron PBS y realizaron análisis bioquímicos; LZ, ZDZ y ZGZ realizaron un experimento crio-EM; LZ y GW realizaron la construcción de modelos para la determinación de estructuras; JW, HL y HC realizaron análisis espectroscópicos ultrarrápidos de PBS; LZ, ZGZ, NG, GW, YW y JZ analizaron e interpretaron los datos. LZ, NG, YW y JZ escribieron el manuscrito con la ayuda de todos los autores.

Correspondencia a Yuxiang Weng, Ning Gao o Jindong Zhao.

Los autores declaran no tener conflictos de intereses.

Nature Communications agradece a Haijun Liu y Florent Waltz por su contribución a la revisión por pares de este trabajo. Un archivo de revisión por pares está disponible.

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Reimpresiones y permisos

Zheng, L., Zhang, Z., Wang, H. et al. Los estudios espectroscópicos de crio-EM y femtosegundos proporcionan información mecanística sobre la transferencia de energía en los ficobilisomas CpcL. Nat Comuna 14, 3961 (2023). https://doi.org/10.1038/s41467-023-39689-7

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Recibido: 27 de enero de 2023

Aceptado: 23 de junio de 2023

Publicado: 05 de julio de 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41467-023-39689-7

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